Nei pazienti con sindrome da stanchezza cronica, è diminuita la capacità dei globuli rossi di modificare la propria forma (Red blood cell deformability is diminished in patients with Chronic Fatigue Syndrome) traduzione studio
La deformabilità cellulare dei globuli rossi è diminuita nei pazienti con sindrome da stanchezza cronica
Red blood cell deformability is diminished in patients with Chronic Fatigue Syndrome
Abstract
BACKGROUND:
L'encefalomielite mialgica / Sindrome da stanchezza cronica (ME / CFS) è una malattia poco conosciuta. Tra gli altri sintomi, la malattia è associata a profonda stanchezza, disfunzione cognitiva, anormalità del sonno e altri sintomi peggiorati dallo sforzo fisico o mentale. Mentre l'eziologia della malattia è ancora dibattuta, le prove suggeriscono il danno ossidativo ai sistemi immunitario ed ematologico come uno dei meccanismi patofisiologici della malattia. Poiché i globuli rossi (RBC) sono ben noti spazzini dello stress ossidativo e sono critici nella perfusione microvascolare e nell'ossigenazione dei tessuti, abbiamo ipotizzato che la deformabilità dei globuli rossi sia influenzata negativamente dalla ME / CFS.
METODI:
Abbiamo utilizzato una piattaforma microfluidica personalizzata e una microscopia ad alta velocità per valutare la differenza di deformabilità dei globuli rossi ottenuti da pazienti ME / CFS e controlli sani corrispondenti per età.
RISULTATI E CONCLUSIONI:
Abbiamo osservato da varie misure di deformabilità che i globuli rossi isolati da pazienti ME / CFS erano significativamente più rigidi rispetto a quelli da controlli sani. Le nostre osservazioni suggeriscono che il trasporto di RBC attraverso i microcapillari può spiegare, almeno in parte, il fenotipo ME / CFS e promette di essere un nuovo test diagnostico di primo passaggio.
METODI:
Abbiamo utilizzato una piattaforma microfluidica personalizzata e una microscopia ad alta velocità per valutare la differenza di deformabilità dei globuli rossi ottenuti da pazienti ME / CFS e controlli sani corrispondenti per età.
RISULTATI E CONCLUSIONI:
Abbiamo osservato da varie misure di deformabilità che i globuli rossi isolati da pazienti ME / CFS erano significativamente più rigidi rispetto a quelli da controlli sani. Le nostre osservazioni suggeriscono che il trasporto di RBC attraverso i microcapillari può spiegare, almeno in parte, il fenotipo ME / CFS e promette di essere un nuovo test diagnostico di primo passaggio.
1. Introduzione
L'encefalomielite mialgica / Sindrome da stanchezza cronica (ME / CFS) è una malattia plurisistemica debilitante di eziologia sconosciuta che colpisce milioni di individui in tutto il mondo [1], con capacità di persistere per decenni. Sebbene un profilo anormale di citochine proinfiammatorie circolanti e la presenza di stress ossidativi e nitrosativi cronici siano stati identificati e correlati con gravità nella ME / CFS [2, 3], non ci sono biomarcatori molecolari o cellulari della malattia. Di conseguenza, senza una diagnosi definitiva o addirittura non specifica, la malattia può essere mal diagnosticata o rimanere travestita per un lungo periodo. Di interesse, la forma e le dimensioni dei globuli rossi (RBC) cambiano in modo sensibile in risposta a stress ossidativo e infiammatorio [4, 5]. La solita forma di RBC è discoidale biconcava, che fornisce un rapporto area-volume specifico della superficie che facilita le grandi deformazioni reversibili a qualsiasi forma arbitraria, consentendo il viaggio attraverso i microvasi per l'ossigenazione dei tessuti ottimale [6-8]. La deformazione dei globuli rossi alle forze fisiche è stata studiata come possibile biomarker diagnostico per l'anemia falciforme [9], la malaria [10] e la malattia della guerra del Golfo [11]. In questo studio, abbiamo testato l'ipotesi che la deformabilità dei globuli rossi è significativamente alterata in ME / CFS rispetto alla popolazione normale, utilizzando un dispositivo microfluidico ad alta velocità e microscopia ad alta velocità [10].
2. Materiali e metodi
I pazienti ME / CFS precedentemente diagnosticati da un medico utilizzando il Canadian Consensus Criteria [11] sono stati selezionati per lo studio (n = 16 coppie di pazienti con controlli sani corrispondenti all'età). Il consenso scritto è stato ottenuto a seguito di Stanford IRB-40146. Le età medie erano 52 ± 7.7 per i controlli sani (HC) e 52 ± 6.7 per i pazienti ME / CFS. I punteggi di disabilità erano 94 ± 5,4% per l'HC e 44 ± 19% per i pazienti. Il rapporto femmina-uomo era 9: 7 per il gruppo sano e 11: 5 per il gruppo ME / CFS. Tutti gli esperimenti sono stati condotti entro 3-6 ore dal prelievo di sangue (tutto il tempo a temperatura ambiente), e il tempo esatto non ha influenzato i nostri risultati [12]. Il sangue intero è stato centrifugato a 250 × G per 20 minuti per ottenere la frazione di globuli rossi. Una sospensione diluita (ematocrito ~ 1%) di 107 globuli rossi / ml in PBS (pH 7,4) è stata perfusa attraverso canali microfluidici utilizzando un sistema di erogazione basato su vuoto personalizzato a una pressione di -2 psi. I canali microfluidici erano fatti di polidimetilsilossano (PDMS) usando stampi di silicone, come descritto in precedenza [10]. I canali sono stati lavati con F127 pluronic 0.1% (in PBS), prima che le cellule fossero perfuse, al fine di prevenire l'adesione cellulare non specifica. I globuli rossi si sono mossi attraverso canali di sezione trasversale progressivamente più stretta, partendo da una larghezza di 1 mm rastremata a 20μm prima di entrare nei canali di prova da 5μm × 5μm. Il flusso di globuli rossi attraverso i canali di test da 5 μm è stato visualizzato con ingrandimento 40 × e 4000 fps. I video sono stati analizzati off-line per quantificare tre parametri come misura della deformabilità: tempo di ingresso (tempo impiegato dalle cellule per immettere completamente i canali di test da 5μm); velocità di transito (velocità dei globuli rossi che percorrono una distanza di 100μm attraverso i canali di prova); e indice di allungamento (rapporto della lunghezza dei globuli rossi nel canale di prova rispetto alla lunghezza prima di entrare nel canale di prova) (Fig. 1A).
Fig. 1
Moto dei globuli rossi (RBC) nei canali microfluidici. (A) Tracce rappresentative di un RBC prima, durante e dopo l'ingresso attraverso i canali di test (5μm × 5μm). La barra della scala è 5μm; (B1) Lunghezza della cella (asse maggiore) e (B2) Distribuzione delle lunghezze delle celle, dei globuli rossi prima di entrare nei canali di prova; (C1) Indice di allungamento e (C2) Distribuzione degli indici di allungamento di RBC deformati all'interno dei canali di prova; (D) Confronto tra lunghezze medie ridotte di globuli rossi non deformati (L1) e deformati (L2) da controlli sani e pazienti ME / CFS. Le lunghezze sono state adattate alla larghezza del canale (d = 5μm); (E1) Tempi di ingresso e (E2) Distribuzione dei tempi di ingresso, cioè tempo impiegato dagli RBC per immettere completamente i canali di prova; (F1) Velocità di transito e (F2) Distribuzione delle velocità di transito, in base al tempo impiegato dai globuli rossi per percorrere 100 μm di distanza all'interno dei canali di prova. I risultati sono basati su almeno due dispositivi microfluidici separati per donatore e almeno 100 cellule sono state testate per dispositivo. I risultati sono mostrati come media ± SD. * denota differenze significative rispetto ai campioni sani, basato su ANOVA a 2 vie con analisi post hoc di Tukey (p <0,0001; n = 16 coppie). Per la distribuzione, i risultati sono presentati come istogramma con relativa frequenza in percentuale. HC: RBC da donatori sani; CFS: globuli rossi da pazienti ME / CFS. | |
| i globuli rossi hanno la capacità di modificare la loro forma, se non accade, si possono verificare serie problematiche |
Abbiamo prima convalidato la capacità della piattaforma microfluidica di rilevare i cambiamenti nella deformabilità dei globuli rossi. I globuli rossi di volontari sani sono stati trattati con glutaraldeide allo 0,01% e perfusi, poiché questo trattamento ha dimostrato di avere un effetto di irrigidimento delle cellule [13, 14]. Coerentemente con gli studi pubblicati, abbiamo osservato che le cellule mostrano tempi di ingresso significativamente più alti (~49%), velocità di transito inferiore (~47%) e indice di allungamento inferiore (~7%), rispetto ai globuli rossi non trattati (p <0.0001, n = 3). Successivamente, abbiamo perfuso globuli rossi da controlli sani e pazienti CFS attraverso i canali microfluidici. Abbiamo osservato che il diametro dei globuli rossi prima di entrare nei canali di test nei pazienti ME / CFS era ~ 10% in più rispetto a HC. Gli RBC dei pazienti ME / CFS mostravano una distribuzione più ampia rispetto all'HC e una notevole popolazione di globuli rossi (~ 20%) da pazienti ME / CFS era insolitamente più grande (> 12μm), suggerendo l'impatto variabile della malattia sui globuli rossi isolato da diversi pazienti (Figura 1B). Successivamente, abbiamo osservato una diminuzione di circa il 15% dell'indice di allungamento dei globuli rossi da pazienti ME / CFS rispetto a quelli da HC. La distribuzione degli indici di allungamento mostra che la maggior parte delle cellule (> 70%) dai pazienti ME / CFS non si deformano dopo essere entrati nei canali del test, mentre la maggior parte delle cellule da HC si è deformata di almeno il 10-25% entrando nei canali del test (Fig. 1C). Confrontando la variazione dei diametri delle celle normalizzata fino alla larghezza del canale test prima (L 1 / d) e dopo (L 2 / d), la Fig. 1D dimostra chiaramente che gli RBC dei pazienti ME / CFS si deformano di 7 volte meno rispetto a quelli dell'HC. Le cellule dei pazienti ME / CFS impiegano circa il 14% di tempo in più per entrare nei canali del test (Fig. 1E) e, una volta entrati nei canali, viaggiano di circa il18% più lentamente di quelli di HC (Fig. 1F). Le distribuzioni per il tempo di ingresso e la velocità di transito sono orientate verso valori più bassi per HC e verso valori più alti per quelli per pazienti ME / CFS. A causa della natura della malattia, spesso alla maggior parte dei pazienti è stata prescritta una vasta gamma di farmaci e supplementi a seconda dei loro particolari sintomi e condizioni. Ad esempio, questi farmaci e integratori includono Rituxan e loratadina o naltrexone a basso dosaggio, vitamina D3 ecc. Sulla base di un'ampia ricerca bibliografica, abbiamo trovato solo uno dei farmaci, la colchicina, che è stata prescritta a un paziente, ha dimostrato di influenzare leggermente deformabilità cellulare [15, 16]. Tuttavia, i parametri di deformabilità per questo particolare paziente erano ben compresi nel range per altri pazienti. I pazienti e i volontari si sono identificati come non fumatori [17].
Insieme, le varie stime mostrano che i globuli rossi nei pazienti ME / CFS sono significativamente meno deformabili di quelli di HC. Le nostre osservazioni possono fornire un'opportunità per un test diagnostico di primo passaggio per ME / CFS con un campione di sangue dito-puntura, con un avvertimento che il test può essere non specifico in quanto altre condizioni infiammatorie o co-morbidità esistenti possono alterare la deformabilità dei globuli rossi, e potrebbe dover essere inserito nel contesto di altre presentazioni cliniche. Si ipotizza che gli RBC più grandi e meno deformabili nei pazienti ME / CFS possano parzialmente spiegare il dolore e l'affaticamento muscolo-scheletrico nella fisiopatologia della ME / CFS a causa della perfusione della perfusione microvascolare e dell'ossigenazione tissutale.
Contributi di autore
A.K.S., M.N.G., R.W.D. e A.K.R hanno progettato lo studio, analizzato i dati e scritto il manoscritto. J.W. campioni di sangue prelevati e raccolti da pazienti ME / CFS e controlli corrispondenti. A.K.S., B.R.S., A.A., V.N. e J.K.D hanno eseguito esperimenti di microfluidica.
Divulgazione di conflitti di interesse
Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interesse.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano esprimere il loro sentito apprezzamento a numerosi pazienti ME / CFS e alle loro famiglie per l'accesso al sangue per migliorare la comprensione e il trattamento della malattia. Gli autori desiderano ringraziare la dott.ssa Liat Rosenfeld per aver concesso l'accesso alla telecamera ad alta velocità utilizzata per l'immagine dei movimenti cellulari attraverso microcanali, e la signora Jaime Seltzer per aver fatto commenti utili sulla revisione del manoscritto. Gli autori vorrebbero anche ringraziare la Open Medicine Foundation per il supporto finanziario.
Riferimenti
A.K.S., M.N.G., R.W.D. e A.K.R hanno progettato lo studio, analizzato i dati e scritto il manoscritto. J.W. campioni di sangue prelevati e raccolti da pazienti ME / CFS e controlli corrispondenti. A.K.S., B.R.S., A.A., V.N. e J.K.D hanno eseguito esperimenti di microfluidica.
Divulgazione di conflitti di interesse
Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interesse.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano esprimere il loro sentito apprezzamento a numerosi pazienti ME / CFS e alle loro famiglie per l'accesso al sangue per migliorare la comprensione e il trattamento della malattia. Gli autori desiderano ringraziare la dott.ssa Liat Rosenfeld per aver concesso l'accesso alla telecamera ad alta velocità utilizzata per l'immagine dei movimenti cellulari attraverso microcanali, e la signora Jaime Seltzer per aver fatto commenti utili sulla revisione del manoscritto. Gli autori vorrebbero anche ringraziare la Open Medicine Foundation per il supporto finanziario.
Riferimenti
